Detetección molecular de patógenos en alimentos mediante qPCR y RT-qPCR
LoopSense™ Food Safety es una gama de kits de diagnóstico molecular basada en tecnologías qPCR y RT-qPCR con sonda fluorescente, diseñada para la detección cualitativa, sensible y específica de microorganismos de interés en seguridad alimentaria.
La gama incluye ensayos dirigidos a virus y bacterias relevantes en el control microbiológico de alimentos, aguas, superficies, materias primas y productos procesados.
Entre las dianas disponibles se encuentran:
- Norovirus genogrupo I — NoV GI.
- Norovirus genogrupo II — NoV GII.
- Virus de la hepatitis A — HAV.
- Shigella spp.
- Salmonella spp.
- Listeria monocytogenes.
- Otras dianas de interés en seguridad alimentaria y control microbiológico.
Sistema modular de amplificación y detección
Los ensayos LoopSense™ Food Safety están desarrollados para simplificar la preparación de las reacciones manteniendo un alto rendimiento molecular.
El sistema combina dos componentes principales:
- Master Mix liofilizada: contiene los reactivos necesarios para la retrotranscripción, cuando proceda, y la amplificación mediante PCR en tiempo real.
- Detection Primer Mix líquido: contiene los primers y las sondas fluorescentes específicos para cada microorganismo o diana molecular.
La Master Mix constituye una base común para diferentes ensayos, mientras que la especificidad de cada análisis viene determinada por el Detection Primer Mix seleccionado.
Este formato modular facilita la organización del laboratorio y permite utilizar una misma base liofilizada con diferentes mezclas específicas de detección.
Tecnología qPCR y RT-qPCR
La tecnología utilizada depende de la naturaleza del microorganismo analizado:
- qPCR: utilizada para la detección de objetivos de ADN, como determinadas bacterias.
- One-Step RT-qPCR: utilizada para virus de RNA, incorporando la retrotranscripción y la amplificación en un mismo tubo.
La detección se realiza mediante sondas fluorescentes específicas, lo que permite registrar la señal de amplificación en tiempo real y diferenciar el objetivo de posibles productos inespecíficos.
Reactivos liofilizados
La Master Mix se suministra en formato liofilizado y preparada para su reconstitución antes del análisis.
Ventajas del formato liofilizado
- Reduce la preparación manual de mezclas.
- Disminuye el número de pasos de pipeteo.
- Reduce el riesgo de errores de preparación.
- Facilita la estandarización entre ejecuciones.
- Reduce los ciclos de congelación y descongelación.
- Facilita el almacenamiento y transporte del producto.
- Permite procesar un número reducido de muestras sin desperdiciar una placa completa.
- Mejora la organización de los reactivos en el laboratorio.
La tecnología de liofilización contribuye a mejorar la estabilidad de la mezcla de amplificación durante el almacenamiento y el transporte. Las condiciones de conservación aplicables deben consultarse en la etiqueta y en las instrucciones de uso de cada referencia.
Detection Primer Mix
El Detection Primer Mix es una mezcla líquida que contiene los primers y las sondas fluorescentes específicos para cada diana.
Su función es determinar la especificidad del ensayo, permitiendo utilizar la misma Master Mix liofilizada con diferentes objetivos microbiológicos.
Según la referencia seleccionada, el Detection Primer Mix puede estar diseñado para:
- Detección individual de un microorganismo.
- Detección diferenciada de varios genogrupos.
- Ensayos multiplex con más de un objetivo o control interno.
- Detección simultánea del patógeno y de un control de amplificación.
Características principales
- Tecnología qPCR o One-Step RT-qPCR con sonda fluorescente.
- Detección cualitativa de patógenos de interés alimentario.
- Master Mix común en formato liofilizado.
- Detection Primer Mix específico para cada diana.
- Preparación simplificada de las reacciones.
- Reducción de errores asociados al pipeteo.
- Compatible con plataformas qPCR abiertas.
- Posibilidad de integrar controles internos.
- Adecuado para ensayos individuales y multiplex.
- Disponible en diferentes formatos de reacciones.
- Uso exclusivo para investigación y control de calidad.
Principales aplicaciones
Los ensayos LoopSense™ Food Safety pueden integrarse en programas de:
- Control microbiológico de alimentos.
- Seguridad alimentaria.
- Control de materias primas.
- Análisis de productos procesados.
- Control de aguas de proceso.
- Análisis de aguas destinadas a diferentes usos.
- Monitorización de superficies e instalaciones.
- Verificación de procesos de limpieza y desinfección.
- Investigación de contaminaciones microbiológicas.
- Control de calidad en industrias agroalimentarias.
- Desarrollo y validación de métodos moleculares.
- Estudios de prevalencia y vigilancia microbiológica.
Tipos de muestra
Los kits pueden utilizarse con ácidos nucleicos previamente extraídos de diferentes matrices, siempre que el procedimiento haya sido verificado por el laboratorio.
Las matrices pueden incluir:
- Alimentos frescos.
- Alimentos procesados.
- Frutas y hortalizas.
- Productos cárnicos.
- Productos lácteos.
- Pescados y mariscos.
- Ingredientes y materias primas.
- Agua.
- Concentrados obtenidos a partir de muestras acuosas.
- Hisopos de superficies.
- Caldo de enriquecimiento microbiológico.
- Otras matrices previamente evaluadas por el laboratorio.
Las muestras alimentarias pueden contener grasas, proteínas, sales, polisacáridos, polifenoles y otros compuestos capaces de inhibir la amplificación. Por este motivo, el método de extracción debe seleccionarse de acuerdo con la matriz analizada.
Flujo de trabajo
- Recogida y preparación de la muestra.
- Enriquecimiento microbiológico, cuando proceda.
- Extracción de ADN o RNA.
- Reconstitución de la Master Mix liofilizada.
- Adición del Detection Primer Mix correspondiente.
- Adición del ácido nucleico extraído.
- Incorporación de controles positivos, negativos e internos.
- Ejecución del programa de qPCR o RT-qPCR.
- Adquisición de fluorescencia.
- Validación de los controles.
- Interpretación de las curvas de amplificación y los valores de Cq.
Controles del ensayo
Cada ejecución debe incorporar controles adecuados para verificar el funcionamiento correcto del análisis:
- Control positivo del objetivo.
- Control negativo de amplificación.
- Control negativo de extracción, cuando proceda.
- Control interno de extracción o amplificación.
- Muestras objeto de análisis.
En los ensayos que incluyan un control interno, la señal correspondiente puede registrarse en un canal diferente al utilizado para el patógeno.
La ejecución solamente debe considerarse válida cuando todos los controles cumplen los criterios de aceptación establecidos en las instrucciones de uso.
Interpretación de resultados
La presencia o ausencia del objetivo debe determinarse mediante el análisis de la curva de amplificación y la comparación con los controles del ensayo.
La interpretación debe considerar:
- La amplificación correcta del control positivo.
- La ausencia de señal específica en el control negativo.
- El comportamiento del control interno.
- La forma y consistencia de la curva de amplificación.
- El valor de Cq obtenido.
- Los criterios de aceptación definidos por el laboratorio.
- Las instrucciones y límites establecidos en el IFU.
Un resultado negativo no excluye completamente la presencia del microorganismo cuando la toma de muestra no es representativa, la concentración se encuentra por debajo del límite de detección, la extracción ha sido insuficiente o existen inhibidores.
Equipos compatibles
LoopSense™ Food Safety puede utilizarse en termocicladores de PCR en tiempo real de plataforma abierta que sean compatibles con:
- El volumen de reacción establecido.
- El programa térmico del ensayo.
- Los fluoróforos incluidos en el Detection Primer Mix.
- Los canales necesarios para el objetivo y el control interno.
- El tipo de tubo, tira o placa indicado.
Antes de transferir el ensayo a un nuevo equipo debe verificarse la compatibilidad térmica, óptica y física de la plataforma.
Conservación
Conservar la Master Mix liofilizada y el Detection Primer Mix conforme a las condiciones indicadas en la etiqueta y en las instrucciones de uso.
Los reactivos deben protegerse de la humedad, la luz directa y las temperaturas elevadas durante periodos prolongados.
Una vez reconstituidos o abiertos, deben respetarse las condiciones y tiempos de conservación establecidos para cada componente.
Presentaciones disponibles
Los ensayos LoopSense™ Food Safety pueden suministrarse en diferentes formatos y números de reacciones.
La configuración comercial puede incluir:
- Master Mix liofilizada.
- Detection Primer Mix específico.
- Control positivo.
- Control interno, según la referencia.
- Instrucciones de uso.
Los kits de extracción, consumibles y equipos de amplificación se suministran por separado, salvo que se indique expresamente lo contrario.
LoopSense™ Food Safety se comercializa exclusivamente para Research Use Only — RUO—, investigación, desarrollo y control de calidad. No destinado a diagnóstico clínico humano.
Preguntas frecuentes
¿Qué diferencia existe entre la Master Mix y el Detection Primer Mix?
La Master Mix contiene los reactivos generales necesarios para realizar la amplificación. El Detection Primer Mix contiene los primers y sondas que determinan qué microorganismo se detecta.
¿La misma Master Mix puede utilizarse para diferentes patógenos?
Sí. Cuando las referencias son compatibles, puede utilizarse una base común liofilizada y cambiar únicamente el Detection Primer Mix correspondiente a cada diana.
¿Qué ensayos utilizan RT-qPCR?
Los objetivos de RNA, como Norovirus GI, Norovirus GII y el virus de la hepatitis A, requieren una etapa de retrotranscripción y se analizan mediante One-Step RT-qPCR.
¿Qué ensayos utilizan qPCR?
Los microorganismos cuyo objetivo molecular es ADN, como determinadas bacterias, pueden analizarse directamente mediante qPCR sin etapa de retrotranscripción.
¿El kit incluye la extracción de ácidos nucleicos?
No, salvo que la referencia indique expresamente lo contrario. El ensayo se utiliza con ADN o RNA previamente extraído y purificado.
¿Es obligatorio realizar un enriquecimiento?
Depende del microorganismo, la matriz, la concentración esperada y el objetivo del análisis. Algunos métodos bacterianos pueden requerir una etapa previa de enriquecimiento microbiológico.
¿Puede utilizarse en cualquier equipo de qPCR?
Puede utilizarse en plataformas abiertas compatibles con el programa térmico, los fluoróforos, el volumen de reacción y los consumibles indicados en el IFU.
¿El producto sustituye a un método oficial?
No necesariamente. Las decisiones regulatorias y de liberación de producto deben basarse en la legislación aplicable y en los procedimientos reconocidos por las autoridades competentes.
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